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嘌呤霉素

嘌呤霉素

簡要描述:嘌呤霉素
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產品型號: 58-58-2

所屬分類:抗生素

更新時間:2019-05-27

詳細說明:

嘌呤霉素

產品名稱CAS貨號規格價格
嘌呤霉素58-58-2Y823025mg400
嘌呤霉素58-58-2Y8230100mg1500

溶解性 50 mg/mL in water

別名 二鹽酸嘌呤霉素;嘌呤霉素鹽酸鹽

英文名稱 Puromycin

CAS 58-58-2

分子式 C22H29N7O5·2HCl

分子量 544.44

儲存條件 -20℃

危險代碼 R:22

純度 PURITY: ≥99%

外觀(性狀) 白色或白中帶有黃色的粉末

 

說明:蛋白質合成抑制劑。抑制細菌、藻類原生物和哺乳動物細胞生長。

嘌呤霉素(Puromycin)是由白黑鏈霉菌(Streptomyces alboniger)發酵代謝產生的一種氨基糖苷類抗生素,通過抑制蛋白質合成而殺死革蘭氏陽性菌,各種動物和昆蟲細胞。某種特殊情況下有效作用大腸桿菌。作用機制在于嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3’末端的類似物,能夠與核糖體的A位點結合并摻入到延伸的肽鏈中。嘌呤霉素同A位點結合后,不會參與隨后的任何反應,從而導致蛋白質合成的提前終止并釋放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。

嘌呤霉素產生菌Streptomyces alboniger內發現的pac基因編碼嘌呤霉素N-乙酰轉移酶(PAC),賦予機體對嘌呤霉素產生抗性。這一特性如今普遍應用于篩選特定攜帶pac基因質粒的哺乳動物穩定轉染細胞株。

嘌呤霉素在細胞穩轉株篩選中的普遍應用與慢病毒載體的特性有關,現在商業化的慢病毒載體多數都攜帶pac基因。在某些特定情況下,嘌呤霉素亦可以用來篩選轉化攜帶pac基因質粒的大腸桿菌菌株。

溶解性:溶于水,參考濃度50mg/ml。

使用方法

1.建議使用濃度

哺乳動物細胞:1-10 μg/mL,jia濃度需要殺滅曲線來確定;

大腸桿菌:LB瓊脂培養基篩選穩定轉化pac基因的大腸桿菌,使用濃度為125μg/mL。注:使用嘌呤霉素篩選大腸桿菌穩轉株需要精確的pH值調節,而且受宿主細胞本身的影響。

2.溶解方法

用蒸餾水溶解嘌呤霉素配制成50 mg/ml的母液,經0.22 μm濾膜過濾除菌后分裝于-20℃凍存;也可溶于甲醇,配制成10 mg/ml的儲存液。

3. 嘌呤霉素殺滅曲線的確定(以shRNA轉染或者慢病毒轉導為例)

嘌呤霉素有效篩選濃度跟細胞類型、生長狀態、細胞密度、細胞代謝情況及細胞所處細胞周期位置等有關。為了篩選到穩定表達的shRNA細胞株,確定殺死未轉染/轉導細胞的低濃度嘌呤霉素至關重要。建議初次做實驗的客戶一定要建立適合自身實驗體系的殺死曲線(kill curve)。

1) Day 1:24孔板內以5~8 x 104 cells/孔的密度鋪板,鋪足夠量的孔以進行后續的梯度實驗。37℃細胞孵育過夜;

2) Day 2:a)準備篩選培養基:含不同濃度嘌呤霉素的新鮮培養基(如0-15μg/mL,至少5個梯度);b)往孵育過夜后的細胞內更換新鮮配制的篩選培養基;之后37℃孵育細胞;

3) Day 4:更換新鮮的篩選培養基,并觀察細胞存活率。

4) 根據細胞的生長狀態,約2-3天更換新鮮的篩選培養基;

5) 每日監測細胞,觀察存活細胞率,從而確定抗生素篩選開始4-6天內有效殺死非轉染或者所有非轉導細胞的藥物低濃度。

4. 哺乳動物穩定轉染細胞株的篩選

等轉染含有pac基因的質粒后,細胞在含有嘌呤霉素的培養基中增殖,以篩選出穩定轉染子。

1)細胞轉染48h后,將細胞(原樣或稀釋)置于含有適當濃度嘌呤霉素的新鮮培養基中培養。

注意:當細胞處于分裂活躍期時,抗生素作用明顯。細胞過于密集,抗生素產生的效力會明顯下降。hao進行細胞分盤使其密度不超過25%。

2)每隔2-3天,移除和更換含有嘌呤霉素的培養基。

3)篩選7天后評估細胞形成的病灶。病灶可能需要額外的一周或者更多時間,這依賴于宿主細胞系和轉染篩選效率。注意:每日進行細胞生長狀態的觀察。嘌呤霉素的篩選至少需要48h,有效濃度嘌呤霉素的篩選周期一般在3-10天。

4)轉移和放置5-10個抗性克隆到一個35mm的培養皿中,用選擇培養基繼續培養7天。此次富集培養是為日后的細胞毒性實驗做準備。

注意事項

1)為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。

2)嘌呤霉素為有毒化合物,操作時請小心拿放。

 


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(注:本試劑只用于科研,咨詢!
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